نانوحسگری برای تشخیص ویروس کرونا با چشم غیرمسلح - وبلاگ دانشجو

به گزارش وبلاگ دانشجو، محققان اثربخشی زیست حسگر CASCADE خود را بررسی کردند. این حسگر امکان تشخیص اسید ریبونوکلئیک (RNA) ویروس کرونا را با چشم غیر با کمک نانوذرات طلا (AuNPs) فراهم می کند.

به گزارش گروه دانشگاه وبلاگ دانشجو، در مقاله ای که به تازگی در نشریه Analytica Chimica Acta به چاپ رسیده است، محققان اثربخشی زیست حسگر CASCADE (تشخیص اسید نوکلئیک رنگ سنجی مبتنی بر CRISPR/CAS) خود را بررسی کردند. این حسگر امکان تشخیص اسید ریبونوکلئیک (RNA) ویروس کرونا را با چشم غیر با کمک نانوذرات طلا (AuNPs) فراهم می کند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-qPCR) استاندارد طلایی برای تشخیص ویروس کرونا است. با این حال، این روش گران بوده و حساسیت بالایی ندارد، بنابراین برای تشخیص سریع نقطه مراقبت (PoC) نامناسب است. تست های PoC رایج مانند تست های آنتی ژن و سنجش های سرولوژیکی به ترتیب قابلیت اطمینان پایین و مدت زمان طولانی دارند. بنابراین، نیاز به روش های تشخیصی دقیق، سریع و اقتصادی PoC برای تشخیص ویروس کرونا احساس می شود. اگرچه روش AuNPs -CRISPR برای تشخیص ویروس کرونا امیدوارکننده است، اما به طور گسترده مورد بررسی قرار نگرفته است.

حسگر CASCADE از پروتئین نوکلئاز Cas CSIPR تشکیل شده است. نانوذرات طلا با توالی های الیگونوکلئوتیدی RNA تک رشته ای (ssRNA) پوشیده شده اند. نوکلئاز Cas با ریبونوکلئوپروتئین (RNP) و RNA راهنما (crRNA) تشکیل کمپلکس می دهد که مکمل اسید نوکلئیک هدف است. تعامل crRNA-هدف، آنزیم Cas 13 را فعال می کند. با تشخیص هدف، تخریب ssRNA از طریق آنزیم نوکلئاز Cas فعال شده انجام می شود و در ادامه تجمع نانوذرات طلا صورت می گیرد. این فرآیند منجر به کاهش شدت جذب و تغییر رنگ به طول موج های بالاتر شده که قابل مشاهده برای چشم است. این تغییرات تشخیص RNA ویروس کرونا را تسهیل می کند.

در مطالعه حاضر، محققان حسگر زیستی CASCADE را برای تشخیص با چشم غیر مسلح RNA ویروس کرونا استخراج شده از سواب فرد آلوده با استفاده از AuNPs طراحی کردند.

پروتئین Cas دو نوع است، Cas 12 و Cas 13. فعالیت برشی Cas 13 چندگانه است و بنابراین، سیگنال ها را می توان با استفاده از بسکمک از الیگونوکلئوتید های غیر اختصاصی تقویت کرد. علاوه بر این، Cas 13 به دنباله موتیف مجاور پروتوسپیسر (PAM) نیاز ندارد. استفاده از نوکلئاز Cas 13 تطبیق پذیری حسگر را افزایش داد.

این تیم نانوذرات طلا با سه قطر 34، 22 و 12 نانومتر را سنتز کردند و آن ها را با الیگونوکلئوتید های RNA 3 برای شناسایی اهداف ژن SARS-CoV-2-ORF 1 ab و سنبله (S) پوشاندند. نانوذرات طلا 12 نانومتری سریع ترین تشخیص هدف را با تغییرات رنگ شدید در عرض 15 دقیقه ایجاد کرد و بنابراین برای حسگر انتخاب شد.

طول و مقدار پوشش ssRNA روی نانوذرات طلا برای ارزیابی پایداری نانوذرات طلا بررسی شد. هرچه طول ssRNA بیشتر باشد، نانوذرات طلا پایدارتر شده و تجزیه آنزیمی کارآمدتر Cas 13 را در پی خواهد داشت. بنابراین، سه طول توالی RNA مورد بررسی قرار گرفت: 33، 23، و 13 nt. از این میان، RNA با طول 33 nt قوی ترین تشخیص هدف و بیشترین کاهش جذب را ارائه کرد. برای ارزیابی مقدار پوشش، سه گزینه (2.3، 1.5، و 0.7 pmol µL-1) مورد آزمایش قرار گرفت که از این میان، 2.3 pmol µL-1 کارآمدترین و برای حسگر انتخاب شد.

پایداری طولانی مدت نیز با نگهداری ssRNA 3-AuNPs در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت پنج ماه قبل از استفاده ارزیابی شد. پس از ذخیره سازی، عملکرد آن ها مشابه عملکرد نانوذرات طلا تازه آماده شده بود. این نتایج نشان می دهد که ssRNA 3-AuNP پایداری طولانی مدت بالایی دارد که قابلیت حمل حسگر را نیز افزایش می دهد.

مناسب ترین غلظت نانوذرات طلا ارزیابی شد و سه غلظت 12، 23 و 47 نانومولار بررسی شد که غلظت 4/23 نانومولار بیشترین کاهش جذب و تغییر رنگ را نشان داد. بنابراین، این غلظت نانوذرات طلا برای حسگر انتخاب شد.

سرعت تشخیص و ویژگی حسگر نیز با استفاده از هدف Orf 1 ab مورد ارزیابی قرار گرفت که منجر به تجمع نانوذرات طلا با تغییرات طیفی قابل تشخیص بصری در عرض دو دقیقه شد. این موضوع نشان می دهد که حسگر RNA ویروس را به سرعت تشخیص می دهد.

یافته های این مطالعه نشان داد که حسگر زیستی CASCADE یک دستگاه سریع، همه کاره و قابل حمل است که می تواند برای تشخیص موثر RNA ویروس کرونا با چشم غیر مسلح در نمونه های بالینی با قابلیت اطمینان و حساسیت بالا مورد استفاده قرار گیرد.